紫外分光光度法测定蛋白质含量

摘要： 考马斯亮兰G250与蛋白质结合，在0－1000ug/ml范围内，于波长595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，可用于蛋白质含量的测定。考马斯亮兰G250与蛋白质结合迅速，结合产物在室温下10分钟内较为稳定，是一种较好的蛋白质定量测定方法。 1. 实验部分 1.1 仪器与试剂： Labtech UV POWER紫外分光光度计；玻璃比色皿一套；考马斯亮蓝G250； 牛血清蛋白；超纯水。 1.2 试液的制备： 牛血清蛋白标准溶液（1000ug/ml）的制备 称取100mg牛血清蛋白置100ml容量瓶中，加入超纯水溶解并定容。 考马斯亮兰G250试剂 称取100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml95％的乙醇后，加入120ml85％的磷酸，用水稀释至1升。 2. 结果与讨论 2.1 校正曲线的绘制 准确吸取1000ug/ml牛血清蛋白标准溶液0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml分别加入到6只10ml试管中，然后用超纯水补充到0.1ml，各试管分别加入5ml考马斯亮兰G250试剂，混合均匀后，即可依次在595nm处测定吸光度。以浓度 为横坐标，吸光度为纵坐标绘制校正曲线如下图，校正曲线方程为A=0.613556C+0.001008，R=0.9994。 2.2 精密度 配制0.6mg/ml牛血清蛋白的考马斯亮兰溶液连续进样6次，得到吸光度的相对标准偏差。 表1 精密度测定结果 次数 1 2 3 4 5 6 RSD% A 0.2626 0.2622 0.2620 0.2628 0.2629 0.2626 0.13 2.3 稳定性 取1mg/ml牛血清蛋白标准溶液每十分钟测定一次，50分钟内的吸光度变化如下表2。 表2 稳定度测定结果 时间（min） A1 A2 A3 A平均 0 0.5511 0.5523 0.5516 0.5517 10 0.5204 0.5184 0.5168 0.5185 20 0.4910 0.4901 0.4903 0.4905 30 0.4765 0.4716 0.4721 0.4734 40 0.4524 0.4475 0.4440 0.4480 50 0.3982 0.3935 0.4031 0.3983 3. 结论 该方法测定快速、简便，干扰物少，是目前灵敏度较高的蛋白质含量测定的紫外分光光度法。